Антиоксидантная активность биологических объектов,фагоцитоз, потенциометрия

Антиоксидантная активность биологических объектов,фагоцитоз, потенциометрия

Активные формы кислорода (АФК) играют двойственную биологическую роль в организме человека. АФК являются необходимым элементом фагоцитоза, при котором происходит разрушение поврежденных, старых, иммунологически несовместимых или злокачественных клеток и клеток, пораженных вирусами. Кроме того, благодаря высокой химической активности АФК выполняют функцию сигнальных внутриклеточных трансдьюсеров и межклеточных медиаторов.

При воздействии ряда неблагоприятных факторов, наблюдается избыточное образование АФК. Его патологические последствия проявляются при чрезмерном накоплении АФК и продуктов окисления биомолекул – состоянии, называемом окислительным стрессом. Факторы, вызывающие окислительный стресс, различны, но все они приводят к окислительной модификации макромолекул, т.е. повреждению ДНК, белков, липидов и т.д. В здоровом организме сохраняется равновесие в системе оксидантыантиоксиданты.

Окислительно-восстановительные реакции - согласованная антиоксидантная система

Поддержание окислительно-восстановительных реакций на стационарном уровне обеспечивается действием согласованной антиоксидантной системы. Для коррекции состояния антиоксидантной системы необходима информация о наличии и интенсивности окислительного стресса, что может быть сделано путем оценки антиоксидантной активности (АОА) различных биологических сред.

Существует ряд методов оценки состояния антиоксидантной системы. Основными из них являются: определение радикальной активности, продуктов перекисного окисления макромолекул, индивидуальных антиоксидантов (АО) (ферментативных и неферментативных) и оценка интегральной антиоксидантной активности. Сложность методик и аппаратуры, возможность использования только для анализа неокрашенных жидкостей, отсутствие единого терминологического подхода, неоднозначность данных препятствуют их применению в медицинской экспресс-диагностике. Наиболее доступными и экспрессными методами оценки АОА являются электрохимические методы.

Кроме преимуществ, связанных с доступностью, низкой стоимостью аппаратуры и реактивов, они позволяют напрямую оценить электроннодонорно-акцепторные свойства исследуемой системы, т.е. свойства определяющие, антиоксидант/оксидантный баланс организма. В представленной работе в качестве метода исследования антиоксидантной активности биологических объектов используется потенциометрический метод. Его использование позволяет существенно упростить и ускорить процесс получения информации об АОА в медицинской практике.

Потенциометрический метод определения антиоксидантной активности и разработка новых алгоритмов определения АОА биологических объектов 

Развитие потенциометрического метода определения антиоксидантной активности и разработка новых алгоритмов определения АОА биологических объектов с использованием медиаторной системы и потенциометрической детекции.
Для достижения поставленной цели необходимо решить следующие задачи:

1. Исследовать взаимодействие медиаторной системы K3[Fe(CN)6]/K4[Fe(CN)6] с отдельными антиоксидантами и биологическими объектами, разработать 4 алгоритмы определения антиоксидантной активности крови и ее фракций, семенной и фолликулярной жидкостей.
2. Исследовать реакции взаимодействия радикального инициатора ААРН с медиаторной системой, оценить возможность использования потенциометрического метода для оценки скорости и константы генерирования пероксидных радикалов.
3. Разработать новый потенциометрический метод определения антиоксидантной активности с использованием реакции радикальной инициации и потенциометрической детекции.
4. Провести корреляционные исследования результатов определения антиоксидантной активности плазмы крови потенциометрическим методом и спектрофотометрическим методом TAS Randox.
5. Провести корреляционные исследования результатов определения антиоксидантной активности индивидуальных антиоксидантов и образцов эритроцитарной массы, полученных потенциометрическим методом с использованием радикальных взаимодействий и без использования радикального инициатора. 6. Провести клинические исследования АОА плазмы крови и семенной жидкости, выявить взаимосвязи величины АОА с наличием патологических состояний организма.

Научная новизна

Впервые показана возможность исследования радикальных реакций потенциометрическим методом с использованием медиаторной системы K3[Fe(CN)6]/K4[Fe(CN)6]. Разработан новый потенциометрический метод исследования антиоксидантной активности с использованием радикального инициатора 2,2'-азобис(2-амидинопропан) дигидрохлорида (AAPH). Разработанным методом исследованы растворы индивидуальных антиоксидантов и эритроцитарной массы. Показана высокая степень корреляции результатов определения антиоксидантной активности потенциометрическим методом с реакцией радикальной инициации и без ее использования. Разработаны новые алгоритмы анализа антиоксидантной активности крови и ее фракций, семенной и фолликулярной жидкостей. Получены новые знания в области исследования антиоксидантной активности биологических жидкостей.

Проведены корреляционные исследования плазмы крови независимым спектрофотометрическим методом TAS Randox. Выявлены корреляционные зависимости между антиоксидантной активностью фолликулярной жидкости и сыворотки крови. Выделен вклад гемоглобина и клеточной составляющей антиоксидантной активности в суммарную восстановительную способность крови и эритроцитарной массы.

метод использован в клинических исследованиях плазмы крови и семенной жидкости. Выявлена корреляционная зависимость АОА плазмы крови пациентов с болезнями системы кровообращения и сахарным диабетом II типа. Установлены различия в величине АОА семенной жидкости при различных видах патологии репродуктивной функции. Практическая значимость.

Разработаны алгоритмы определения антиоксидантной активности биологических жидкостей. Предложена экспрессная и простая методика определения АОА крови и ее фракций, семенной и фолликулярной 5 жидкостей. Методика определения антиоксидантной активности цельной крови, эритроцитарной массы, плазмы, сыворотки аттестована в ФГУП УНИИМ. С использованием потенциометрического метода с медиаторной системой определены скорость генерирования пероксидных радикалов, константа генерирования. Метод использован в клинических исследованиях. Высокая степень корреляции результатов антиоксидантной активности с наличием патологического состояния позволяет использовать данный параметр в медицинской практике. Доступность и простота приборного оформления позволяет использовать потенциометрический метод для масштабных медицинских исследований.

На защиту выносятся:

1. Результаты исследования взаимодействия медиаторной системы K3[Fe(CN)6]/K4[Fe(CN)6] с индивидуальными антиоксидантами, цельной кровью и ее фракциями, семенной и фолликулярной жидкостями и алгоритмы определения АОА этих жидкостей потенциометрическим методом с медиаторной системой 2. Методики определения антиоксидантной активности крови и ее фракций, семенной и фолликулярной жидкостей. 3. Новый потенциометрический метод с медиаторной системой для исследования радикальных реакций 4. Новый метод потенциометрической оценки антиоксидантной активности с использованием взаимодействия пероксидных радикалов с исследуемым объектом 5. Результаты корреляционных исследований плазмы крови предложенным и спектрофотометрическим методом TAS Randox 6. Результаты корреляционных исследований индивидуальных антиоксидантов и образцов эритроцитарной массы потенциометрическим методом с использованием радикальных реакций и без ее использования 7. Результаты исследования антиоксидантной активности плазмы крови пациентов с болезнями системы кровообращения и сахарным диабетом II типа 8. Результаты исследования антиоксидантной активности семенной жидкости при различных видах патологии репродуктивной функции.

Апробация работы

. Основные результаты работы представлены на XVIII Менделеевском съезде по общей и прикладной химии (Москва, 2007), Международном семинаре «Загрязнение ртутью окружающей среды: эмиссия в атмосферу, восстановление территорий, влияние на здоровье» (Астана, 2007), Научно-практической конференции «Электрохимические методы анализа в контроле и производстве» (Томск, 2007), 11-й Международной семинар-ярмарке «Российские технологии для индустрии» «Нанотехнологии в электронике, энергетике, экологии и медицине» (Санкт-Петербург, 2007), 3rd International Symposium on Recent advances in food analysis (Prague, Czech Republic, 2007), VII Всероссийской конференции по электрохимическим метода анализа с международным участием (Уфа-Абзаково, 2008), ISTC Science Workshop at the International Conference on Contamination Soil (Center-Fiera Milano, Italy, 2008), 12th International Conference on Electroanalysis (Prague, Czech Republic, 2008), Международном конгрессе "Репродуктивное здоровье населения Урала и Сибири" (Екатеринбург, 2008), II Международном форуме "Аналитика и аналитики" (Воронеж, 2008), Всероссийской конференции молодых 6 ученых и III школы им. академика Н.М. Эммануэля «Окисление, окислительный стресс, антиоксиданты» (Москва, 2008), Ninth workshop on (Bio)sensors and bioanalytical microtechniques in environmental and clinical analysis (Montreal, Canada, 2009), XV Symposium «Euroanalysis 2009» (Innsbruck, Austria, 2009), III Всероссийской конференции с международным участием «Аналитика России-2009» (Туапсе, 2009), Съезд аналитиков России (Москва (пансионат «Клязьма»), 2010). Публикации. По материалам диссертации опубликованы 1 статья в издании, рекомендованном ВАК,

1 глава в книге и тезисы 18 докладов. Диссертация выполнена при поддержке гранта Российского Фонда Фундаментальных Исследований № 07-03-96071-р_урал_а «Исследование антиоксидантной активности биологических объектов, природных и вновь синтезированных соединений с использованием потенциометрического метода анализа»

Практическая значимость и положения, выносимые на защиту.

Рассмотрены механизмы возникновения окислительного стресса, его роль в патогенезе различных заболеваний и основные методы оценки окислительного стресса, такие как методы определения радикальной активности, продуктов окисления биомолекул и определение антиоксидантной активности как ферментативных, так и неферментативных антиоксидантов. В

Аппаратура, реактивы, объекты исследования и используемые методы. Глава 3 посвящена исследованию взаимодействия медиаторной системы с цельной кровью и ее фракциями, семенной и фолликулярной жидкостями, разработке алгоритмов определения АОА этих жидкостей.

Глава 4 посвящена исследованию взаимодействия медиаторной системы с пероксидными радикалами разработке потенциометрического метода определения АОА с использованием радикального инициатора. В главе 5 приведены сравнительные исследования антиоксидантных свойств биологических жидкостей методами, включающими и не включающими стадию генерирования радикалов.

Обосновано использование последнего в анализе биологических объектов. Глава 6 посвящена применению потенциометрического метода в клинических исследованиях и выявлению взаимосвязи величины антиоксидантной активности с наличием патологического состояния.

ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ ЧАСТЬ

Аппаратура

Потенциометрические измерения проводили с использованием многофункционального потенциометрического анализатора «МПА-1» (НПВП «ИВА», г. Екатеринбург) и пилотного образца потенциометрического анализатора АОТ-1 с интерфейсом RS232 (НПВП «ИВА», г. Екатеринбург). Применяли двухэлектродную электрохимическую ячейку: хлоридсеребряный электрод сравнения (Ag/AgCl / нас. KCl) и платиновый screen-printed электрод (НПВП «ИВА», г. Екатеринбург), в качестве рабочего электрода.

Объекты исследования

Растворы АО: аскорбиновая кислота, мочевая кислота, цистеин гидрохлорид, глутатион, билирубин, пирогаллол, адреналин гидрохлорид, дофамин гидрохлорид, норадреналин, 3,4-дигидроксифенилаланин; - Цельная кровь и ее фракции: плазма, сыворотка, эритроцитарная масса; - Семенная жидкость; - Фолликулярная жидкость.

Методы исследования

Потенциометрический метод оценки антиоксидантной активности с использованием медиаторной системы Источником информации об АОА служил сдвиг потенциала Pt-электрода в медиаторной системе K3[Fe(CN)6]/K4[Fe(CN)6], наблюдающийся при введении образца в раствор.

Данный сдвиг является следствием химического взаимодействия АО с K3[Fe(CN)6], т.е. изменения соотношения окисленной и восстановленной форм компонентов медиаторной системы в результате реакции: a·Fe(III) + b·АО = a·Fe(II) + b·AOОx (1) где АО – антиоксидант, AOОx – продукт окисления антиоксиданта; a,b – стехиометрические коэффициенты реакции. АОА (М-экв) рассчитывали по формулам (2-3). α α + − = 1 Ox CC Re d AOA (2) RTnFEE С COxd 3.2/)( Re 1 10/ − α ⋅= , (3) где E – начальный потенциалы системы, мВ; E1 – потенциал системы, установившийся после введения пробы, мВ; СOx – концентрация K3[Fe(CN)6], М; СRed – концентрация K4[Fe(CN)6], М. 7 Спектрофотометрический метод оценки антиоксидантной активности TAS Randox Принцип метода заключается в совместном инкубировании ABTS (2,2'-азинобис-(этилбензтиазолино-6-сульфонат)) с метмиоглобином и Н2О2 с образованием катион-радикала ABTS•+. Полученный раствор имеет относительно стабильный зелено-голубой цвет за счет ABTS•+, обладающий максимумом поглощения при длине волны 600 нм. АО, содержащиеся в тестируемой пробе, уменьшают оптическую плотность пропорционально их концентрации в образце.

ОСНОВНОЕ СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ

1. Разработка алгоритмов определения АОА цельной крови и ее фракций, семенной и фолликулярной жидкостей

1.1. Выбор сенсора

Ранее при разработке потенциометрического метода анализа АОА в качестве рабочего был использован дорогостоящий и хрупкий ORP-electrode (Phoenix, США). Нами для потенциометрических измерений предложен платиновый screen-printed электрод, изготовленный методом трафаретной печати путем нанесения платиновой пасты на керамическую подложку с последующим отжигом. Предлагаемый электрод можно изготовить полупромышленным способом в лабораторных условиях, он прост конструктивно и имеет доступную стоимость.

Общий вид Pt-электрода представлен на рис. 1.

Рис. 1. Screen-printed Pt-электрод: 1 – подложка из керамического материала, 2 - Ptсодержащий слой (контактная зона электрода), 3 – слой изолятора, 4 - Ptсодержащий слой (рабочая зона электрода). В таблице 1 представлены результаты измерения потенциалов различных медиаторных систем, полученные с использованием ORP-electrode (Phoenix), платинового электрода («Metrohm», Швейцария) и двух произвольно выбранных screen-printed электродов (НПВП «ИВА», г. Екатеринбург). Таблица 1. Потенциалы платиновых электродов и предлогарифмический коэффициент уравнения Нернста, наблюдающиеся при изменении концентрации компонентов медиаторной системы (n=5, P=0,95). ∆Е, мВ COx/CRed, М/М lg (COx/ CRed) Pt-электрод (Metrohm) Платиновый ORP-electrode (Phoenix) Screenprinted Ptэлектрод 1 Screenprinted Ptэлектрод 2 0,001/0,0001 1 261±1 260±2 262±1 263±2 0,001/0,00005 1,3 278±1 277±2 276±2 275±2 0,0025/0,00005 1,7 298±2 300±1 296±2 298±1 0,01/0,0001 2 320±2 318±2 319±2 321±2 d(∆Е)/d(lg (COx/CRed)) 59±1 58±1 58±1 59±1 Потенциалы screen-printed Pt-электродов хорошо воспроизводимы, зависимость потенциала от соотношения концентраций компонентов медиаторной системы имеет практически линейный вид (R2 =0,98) и предлогарифмический коэффициент зависимости E=f(lg(COx/CRed) близок к расчетному. Отсюда следует, 8 что платиновые screen-printed электроды не уступают дорогостоящим электродам промышленного изготовления и могут быть использованы в качестве измерительных.

1.2. Исследование и анализ крови и ее фракций

Исследование растворов индивидуальных антиоксидантов и раствора, моделирующего состав плазмы крови Исследованы растворы некоторых АО, входящих в состав биологических объектов: - соединения, обладающие антиоксидантными свойствам за счет наличия в молекуле групп –ОН (мочевая кислота, аскорбиновая кислота); - тиольные соединения (глутатион, цистеин); - азотсодержащие гетероциклические соединения (билирубин). Стехиометрические коэффициенты реакций, определённые экспериментально, приведены в таблице 2, Таблица 2. Стехиометрические коэффициенты реакции взаимодействия некоторых АО с медиаторной системой (n=5, P=0,95). Концентрация АО, мМ АОА раствора, мМ-экв Sr Стехиометрические коэффициенты (a:b в реакции (1)) Мочевая кислота (С=1мМ) N N N N OH OH OH 1,40±0,04 0,02 1,4:1 Аскорбиновая кислота (С=1мМ) O OH OH C H O OH CH2OH 2,02±0,05 0,02 2:1 Глутатион (С=1мМ) OH O NH2 O NH SH O NH O OH 0,99±0,03 0,02 1:1 Цистеин (С=1мМ) OH O NH2 SH 1,01±0,02 0,01 1:1 (Билирубин С=8,55·10-2мМ) N H 3CH O N H N H N H O CH2 CH2 COOH COOH 3CH CH3 CH3 1,69·10-1 ±0,04·10-1 0,03 2:1 9 10 Найденные стехиометрические коэффициенты соответствуют теоретически ожидаемым, т.е. количеству функциональных групп в молекуле АО, отвечающих за его восстановительные свойства (-OH в составе бензольного ядра; -SH; -OH, -NH в составе герероциклического соединения). Из приведенных антиоксидантов смоделирован антиоксидантный состав плазмы крови, в модель вводили альбумин как основной белок плазмы. Результаты приведены в таблице 3.

Таблица 3. Результаты определения АОА раствора, моделирующего антиоксидантный состав плазмы крови (n=5, P=0,95).

Соединение Концентрация АОА ожидаемая, мМ-экв АОА измеренная, мМ-экв Sr Мочевая кислота 0,37·10-3 М Аскорбиновая кислота 0,06·10-3 М Глутатион 0,02·10-3 М Цистеин 0,015·10-3 М Билирубин 0,01·10-3 М Альбумин 45 г/л 0,70 0,75±0,03 0,02 Полученные результаты определения АОА модельного раствора соответствуют его составу с учетом определенных стехиометрических коэффициентов. Антиоксидантный состав раствора подобран так, чтобы он был близок к составу реальных образцов плазмы крови. Выбор состава медиаторной системы и условий разбавления пробы Критериями выбора концентраций компонентов медиаторной системы служили: достаточная величина сдвига потенциала системы при введении в её раствор исследуемого образца; достаточная скорость протекания химической реакции между АО образца и окисленным компонентом медиаторной системы, стабильность установившегося потенциала медиаторной системы во времени. Согласно математическим расчетам и экспериментальным данным, оптимальным является содержание компонентов медиаторной системы Fe(III)/Fe(II) в электрохимической ячейке в соотношении 100/1. Из экспериментальных данных для анализа цельной крови и эритроцитарной массы выбрана медиаторная система: 0,01 М К3[Fe(CN)6]/0,0001 М К4[Fe(CN)6]. Для анализа сыворотки и плазмы, которые содержат на порядок меньше антиоксидантов, чем кровь и эритроцитарная масса, следует использовать систему содержащую 0,001 М К3[Fe(CN)6]/0,00005 М К4[Fe(CN)6] вместо оптимальной для этих условий (0,001 М К3[Fe(CN)6]/0,00001 М К4[Fe(CN)6]), поскольку при концентрации К4[Fe(CN)6] менее 0,00005 М равновесный потенциал системы практически не устанавливается.

При выборе разбавления пробы (объема аликвоты) учитывали содержание антиоксидантов и доступность исследуемого образца. При большом разбавлении (малая аликвота) найденная величина АОА оказывается заниженной, что, повидимому, обусловлено неполным протеканием реакции взаимодействия 11 антиоксидантов с К3[Fe(CN)6] в этих условиях. При увеличении аликвоты результаты определения АОА перестают зависеть от её величины. Рабочие условия определения антиоксидантной активности образцов приведены в таблице 4. Таблица 4. Рабочие условия определения АОА крови и ее фракций. Объект Медиаторная система СOx/CRed, М/М Объем буферного раствора, содержащего медиаторную систему, мл Объем аликвоты, мл Разбавление образца Эритроцитарная масса 10-2/10-4 10 0,1 100 Цельная кровь 10-2/10-4 10 0,2 50 Плазма, сыворотка 10-3/5⋅10-5 1 0,2 6 Исследование влияния способа подготовки крови и ее фракций на результаты анализа

Результаты исследования влияния используемых антикоагулянтов (гепарин, цитрат натрия, ЭДТА) на найденные значения АОА как индивидуальных АО (аскорбиновая кислота (АК), цистеин), так и их смеси приведены в табл. 5. Таблица 5. Результаты определения АОА модельных растворов в присутствии антикоагулянтов. (n=3, P=0,95). АО Введено, Найдено, мМ-экв мМ-экв Гепарин R, % Цитрат натрия R, % ЭДТА R, % АК 1,00 1,04±0,05 104 1,03±0,05 103 1,09±0,06 109 Цистеин 1,00 9,78±0,07 98 1,02±0,07 102 0,99±0,06 99 АК+Цистеин 2,00 2,03±0,08 101 2,11±0,07 105 1,94±0,11 97 В таблице 6 приведены данные определения АОА одного и того же образца цельной крови, отобранной с перечисленными антикоагулянтами. Таблица 6. Антиоксидантная активность цельной крови, отобранной с различными антикоагулянтами (n=3, P=0,95). Антикоагулянт Концентрация антикоагулянта Соотношение кровь : антикоагулянт АОА крови, мМ-экв Sr Гепарин 5000ЕД/мл 19:1 9,43±0,58 0,03 Цитрат натрия 3,8% 19:1 9,61±0,61 0,03 ЭДТА 6,0% 9:1 9,34±0,31 0,02 Перечисленные антикоагулянты могут быть использованы при определении АОА биологических образцов предлагаемым методом, что подтверждается полученными результатами анализа реальных проб и индивидуальных АО. Получение достоверной информации относительно АОА цельной крови и эритроцитарной массы возможно только после гемолиза и выхода внутриклеточных антиоксидантов в межклеточную среду. Экспериментально получено, что наиболее эффективным является термический гемолиз, т.е. гемолиз путем замораживания образца. Выделение клеточной составляющей антиоксидантной активности крови и эритроцитарной массы При анализе цельной крови и эритроцитарной массы необходимо учитывать наличие гемоглобина (Hb), который играет роль внутриклеточного антиоксиданта. Железо (II) в гемоглобине взаимодействует с К3[Fe(CN6)] медиаторной системы. При окислении гемоглобин переходит в окисленную форму – метгемоглобин (MetHb) (4). К3[Fe(CN)6] + Fe2+(Hb) = K4[Fe(CN)6] + Fe3+(MetHb) (4) Общее содержание железа (II) и клеточных антиоксидантов в образцах крови и эритроцитарной массы обозначим TRA (Суммарная восстановительная способность от англ. Total Reducing Activity). Антиоксидантная активность (АОА) тогда определяется как разность TRA и восстановительной способности железа в гемоглобине (RAFe(2+)). = − RATRAAOA Fe +)2( (5) Восстановительную способность железа в гемоглобине рассчитывали по формуле (6). )2( )2( )( Fe + ×= Fe + HbM Hb C RA ν , (6) где CHb - содержание гемоглобина, г/л; νFe(2+) - число ионов Fe2+ в 1 моле гемоглобина, ν=4; M (Hb) – молярная масса молекулы гемоглобина (68000 г/моль). Коэффициент концентрирования при анализе эритроцитарной массы учитывали, пользуясь из данными определения гематокрита: Ht f 1 = , (7) где f – коэффициент концентрирования; Ht – показатель гематокрита, характеризующий отношение объёма форменных элементов к плазме крови, л/л. Результаты анализа стандартных растворов гемоглобина приведены в табл. 7. Таблица 7. Результаты анализа стандартных растворов гемоглобина (n=5, P=0,95). Содержание гемоглобина в стандартном растворе, г/л Содержание гемоглобина в стандартном растворе, моль/л Рассчитанное RAFe(2+) в стандартном растворе, мМ-экв Найденное RAFe(2+) в стандартном растворе, мМ-экв Sr 70 1,02 4,1 4,0±0,2 0,02 120 1,17 7,1 6,9±0,2 0,01 159 2,34 9,3 9,2±0,3 0,01 Из данных таблицы 7 следует, что гемоглобин вступает в реакцию с окисленным компонентом медиаторной системы, при этом полностью переходя в метгемоглобин в результате окисления всех четырех ионов железа (II) в молекуле гемоглобина.

На рисунке 2 представлена корреляция между результатами найденной TRA и рассчитанной величиной АОА образцов эритроцитарной массы. 12 R2 = 0,82 0 1 2 3 4 5 6 7 8 17 19 21 23 25 27 29 TRA, мМ-экв АОА, мМ-экв Рис. 2. Корреляция между TRA эритроцитарной массы (измеренная величина) и АОА (рассчитанная величина). Корреляция результатов определения TRA и АОА образцов эритроцитарной массы составляет 82%. Величина клеточной АОА в эритроцитарной массе складывается преимущественно из АОА клеток крови и остаточной плазмы. 1.3. Исследование и анализ семенной и фолликулярной жидкостей Выбор состава медиаторной системы и условий разбавления пробы АОА семенной жидкости лежит в пределах от 0,88 до 3,35 мМ-экв, поэтому оптимальной для анализа таких растворов является медиаторная система, содержащая K3[Fe(CN)6]/С(K4[Fe(CN)6]) в соотношении 0,01 М/0,0001 М. Именно система такого состава удовлетворяет описанным ранее критериям. Учитывая целесообразность экономии биологического образца и полноту протекания реакции K3[Fe(CN)6] с антиоксидантами, входящих в состав семенной жидкости, оптимальной является аликвота 0,2 мл, добавленная в 1 мл буферного раствора, содержащего медиаторную систему в указанных концентрациях. Антиоксидантный состав и величина АОА фолликулярной жидкости сходна с АОА плазмы и сыворотки крови, поэтому для определения АОА фолликулярной жидкости также использовали медиаторную систему состава 0,001 М К3[Fe(CN)6]/0,00005 М К4[Fe(CN)6] с разбавлением анализируемого образца в 6 раз. Таблица 8. Рабочие условия определения АОА семенной и фолликулярной жидкостей. Объект Медиаторная система СOx/CRed, М/М Объем буферного раствора, содержащего медиаторную систему, мл Объем аликвоты образца, мл Разбавление образца Семенная жидкость 10-2/10-4 1 0,2 6 Фолликулярная жидкость 10-3/5⋅10-5 1 0,2 6 Выбор фракции и способа подготовки семенной жидкости к анализу 13 14 В качестве объектов анализа использовали нативный эякулят и семенную плазму. Н

ативный эякулят на 95% состоит из семенной плазмы. АОА нативного эякулята практически идентична или незначительно превышает АОА семенной плазмы. В связи с этим, в дальнейшем в качестве объекта анализа использовали нативный эякулят, т.к. это позволяет исключить стадию центрифугирования, что упрощает и ускоряет подготовку образца к анализу. Кроме того, спермиологический анализ, результаты которого используются для оценки связи АОА и патологических состояний (концентрация, подвижность, морфология, количество «круглых» клеток), также проводится с использованием нативного эякулята. Исследовали нативный эякулят • после его разжижения (30 мин), • после разжижения и дальнейшего замораживания (-180 C). Таблица 9. Результаты определения АОА эякулята до и после замораживания (n=3, P=0,95). АОА, мМ-экв № Без замораживания Sr После замораживания Sr 1 1,35±0,11 0,03 1,37±0,04 0,01 2 1,18±0,07 0,02 1,20±0,08 0,03 3 2,74±0,15 0,02 2,68±0,10 0,02 Полученные результаты значимо не различаются. Отсюда следует, что для анализа могут быть использованы как свежие, так и предварительно замороженные образцы. Выбор способа подготовки фолликулярной жидкости к анализу. Фолликулярную жидкость получают пункцией. В образце возможно наличие эритроцитов и клеток эпителия, поэтому перед оценкой АОА фолликулярной жидкости образцы центрифугировали (2000 об/мин, 20 мин). АОА фолликулярной жидкости различных фолликулов не является абсолютно одинаковой, однако значения достаточно близки по величине (табл. 10). Таблица 10. Результаты определения АОА фолликулярной жидкости первого и второго фолликулов, измеренная потенциометрическим методом с медиаторной системой (n=3, P=0,95). АОА, мМ-экв № Первый фолликул Sr Второй фолликул Sr 1 0,99±0,04 0,02 1,03±0,07 0,03 2 1,10±0,06 0,03 0,98±0,06 0,03 3 0,97±0,07 0,03 0,95±0,05 0,02 5 1,11±0,09 0,04 0,96±0,06 0,03 5 0,77±0,05 0,03 0,73±0,03 0,02 Поэтому исследование взаимосвязи АОА с процессами оплодотворения и развития эмбрионов можно проводить, используя фолликулярную жидкость только одного фолликула, что упростит процедуру отбора пробы. Корреляция результатов определения АОА фолликулярной жидкости и сыворотки крови На рисунке 3 приведена корреляция результатов определения АОА фолликулярной жидкости и сыворотки крови. R2 = 0,76 0,8 0,9 1 1,1 1,2 1,3 1,4 1,5 1,6 1,7 1,8 0,65 0,75 0,85 0,95 1,05 1,15 1,25 1,35 1,45 1,55 АОА фолликулярной жидкости, мМ-экв АОА сыворотки крови, мМ-экв Рис. 3. Корреляция результатов определения АОА фолликулярной жидкости и сыворотки крови.
Степень корреляции составляет 76%. Это даёт возможность использовать анализ сыворотки крови вместо фолликулярной жидкости для диагностики оплодотворения, что позволит избежать оперативного вмешательства для получения образцов.

2. Исследование взаимодействия медиаторной системы с пероксидными

радикалами и разработка потенциометрического метода определения антиоксидантной активности с использованием радикального инициатора AAPH 2.1. Исследование реакции взаимодействия пероксидных радикалов с восстановленным компонентом медиаторной системы В качестве источника пероксидных радикалов использовали водорастворимый азоинициатор 2,2´-азобис(2-метилпропионамидин) дигидрохлорид (ААРН), который при термическом воздействии разлагается по следующей схеме: На рисунке 4 показано, что при совместном инкубировании ААРН с медиаторной системой (370 С) наблюдается рост потенциала во времени (Рис. 4). Рис. 4. Зависимость потенциала медиаторной системы (С(K4[Fe(CN)6])/ С(K3[Fe(CN)6]) = 0,001 М/ 0,0001 М) от времени при совместном инкубировании с 0,1 М ААРН при 370 С. Этот рост может быть обусловлен окислением восстановленного компонента медиаторной системы генерируемыми радикалами. 15 На рисунке 5 приведены спектры поглощения света образцами, содержащими 0,0025М K4[Fe(CN)6]; 0,0025М K3[Fe(CN)6] и смесь 0,1М ААРН + 0,01М K4[Fe(CN)6] после инкубирования в течение 90 мин при 370 С. 0 0,2 0,4 0,6 0,8 1 1,2 1,4 370 390 410 430 450 470 Длина волны, нм Оптическая плотность, отн.ед. 1 3 1,6 2 0 0,5 1 1,5 2 0 0,001 0,002 0,003 0,004 0,005 0,006 C (K3[Fe(CN)6]), M Оптическая плотность, отн.ед 2,5 . Рис. 5. Спектры поглощения света образцами, содержащими (1) - 0,0025М K4[Fe(CN)6]; (2) - 0,0025М K3[Fe(CN)6], (3) 0,1М ААРН + 0,01М K4[Fe(CN)6] после инкубирования в течение 90 мин при 370 С. Рис. 6. Зависимость оптической плотности от концентрации K3[Fe(CN)6] (λ=420 нм). При инкубировании K4[Fe(CN)6] в присутствии ААРН наблюдается увеличение оптической плотности в результате увеличения концентрации K3[Fe(CN)6], максимум поглощения света которым фиксируется при длине волны 420 нм. Таким образом, увеличение потенциала медиаторной системы во времени обусловлено взаимодействием генерируемых пероксидных радикалов с восстановленным компонентом медиаторной системы, т.е. скорость генерирования пероксидных радикалов может быть оценена по скорости возрастания концентрации K3[Fe(CN)6]. Это дает возможность исследования радикальных реакций потенциометрическим методом с медиаторной системой. По данным, приведенным на рисунках 5-6, рассчитывали скорость генерирования пероксидных радикалов из 0,1М раствора ААРН. Она равна Wi·107 =1,96±0,09 (Sr=0,02) (n=3, P=0,95).

2.2. Разработка метода исследования кинетики генерирования пероксидных радикалов, определение скорости и константы генерирования Скорость генерирования пероксидных радикалов оценивали по изменению потенциала медиаторной системы при совместном инкубировании (370 С) ААРН с медиаторной системой. Пероксидные радикалы взаимодействуют с K4[Fe(CN)6], что сопровождается увеличением концентрации окисленного компонента по реакциям (8-9). RO2 • + e- → RO2 - (8) [Fe(CN)6] 4- – e- → [Fe(CN)6] 3- (9) 16 Концентрацию K3[Fe(CN)6] в каждый момент времени оценивали по формулам (10-11): α α + − + = 1 Re 3 Oxd Fe С CC RTnFEE С C 3.2/)( 1 10/ − α = ⋅ С (10) Ox Re d (11) где Е, E1 - потенциалы медиаторной системы до и после взаимодействия с пероксидными радикалами, мВ; СOx - концентрация окисленной формы медиаторной системы, M; СRed – концентрация восстановленной формы медиаторной системы, M; Fe3+ -концентрация K3[Fe(CN)6], М. Скорость генерирования принимали равной скорости окисления K4[Fe(CN)6], т.е. скорости увеличения концентрации K3[Fe(CN)6]. Константу скорости генерирования (ki) рассчитывали по формуле (12): Wi = 2ki·[AAPH]= d{K3[Fe(CN)6]}/dt, (12) где Wi – скорость генерирования пероксидных радикалов, М*с -1; [AAPH] – концентрация инициатора ААРН, М; ki – константа скорости генерирования, с -1. Для установления порядка реакции генерирования по восстановленному компоненту медиаторной системы в условиях, когда концентрация образующихся радикалов в единицу времени значительно меньше концентрации восстановителя, использовали K4[Fe(CN)6] в различных концентрациях. Состав выбранных медиаторных систем приведен ниже. Система 1: С(K4[Fe(CN)6])/С(K3[Fe(CN)6]) = 0,01 М/0,0001 М Система 2: С(K4[Fe(CN)6])/С(K3[Fe(CN)6]) = 0,005 М/0,0001 М Система 3: С(K4[Fe(CN)6])/С(K3[Fe(CN)6]) = 0,001 М/0,0001 М В таблице 11 приведены результаты определения скорости и константы генерирования, оцененные с использованием медиаторных систем 1-3. Таблица 11 – Скорость генерирования пероксидных радикалов (Wi), определенная по реакции увеличения концентрации K3[Fe(CN)6] с различными медиаторными системами (С(ААРН)=0,1 М, Т=370 С) (n=5, P=0,95). № системы Wi *, 10-7М·с -1 Sr ki**, 10-6с -1 1 1,87±0,08 0,04 0,94±0,08 2 1,87±0,08 0,04 0,94±0,08 3 1,84±0,06 0,03 0,92±0,06 Wi ср·107 =1,87±0,03 М·с -1 (Sr=0,04) ki ср·106 = 0,93±0,01 с -1 (Sr=0,03) • *Wi рассчитана по изменению концентрации K3[Fe(CN)6] • ** ki = Wi/2[AAPH] Скорость генерирования пероксидных радикалов в изученных условиях не зависит от концентрации медиаторной системы, откуда следует, что порядок реакции по гексацианоферрату (II) можно принять равным нулю. Полученные данные о величине скорости и константы скорости генерирования коррелируют с литературными и, полученными спектрофотометрическим методом данными. Это подтверждает возможность оценки скорости генерирования радикалов по реакции с медиаторной системой. 17 На рисунке 7 приведены зависимости изменения концентрации окисленного компонента медиаторной системы при взаимодействии с ААРН различных концентраций. 

D таблице 12 приведены рассчитанные величины скорости и константы генерирования (n=5, P=0,95). Рис. 7. Зависимость изменения концентрации окисленного компонента медиаторной системы от времени при взаимодействии с ААРН различных концентраций. Таблица 12. Скорость генерирования пероксидных радикалов (Wi), определённая по реакции с медиаторной системой, при различных концентрациях инициатора ААРН (рН=7,4, Т=370 С, медиаторная система С(K4[Fe(CN)6])/ С(K3[Fe(CN)6]=0,005М/0,0001М) (n=5, P=0,95). С(ААРН), М Wi *, 10-7М·с -1 Sr ki**, 10-6с -1 Sr 0,01 0,19±0,01 0,05 0,97±0,04 0,05 0,05 0,94±0,05 0,05 0,94±0,07 0,06 0,1 1,87±0,08 0,04 0,94±0,04 0,04 0,2 3,77±0,18 0,04 0,94±0,04 0,04 0,3 5,56±0,26 0,04 0,93±0,04 0,04 kiср·106 = 0,94±0,04 с -1 (Sr=0,02) • *Wi скорость генерирования, рассчитанная по изменению концентрации K3[Fe(CN)6] • ** ki = Wi/2[AAPH] Линейная зависимость (R2 =0,99) скорости генерирования пероксидных радикалов от концентрации инициатора указывает на первый порядок реакции по ААРН. 2.3. Разработка потенциометрического метода определения антиоксидантной активности с использованием реакции генерирования радикалов инициатором AAPH Антиоксидантную активность оценивали по величине периода индукции (τ, сек). В раствор инициатора в фосфатном буфере (рН=7,4) вносили исследуемый образец. Антиоксиданты, содержащиеся в образце, взаимодействуют с пероксидными радикалами, генерируемыми ААРН. Во время инкубирования (370 С) перемешиваемого раствора через определенные промежутки времени отбирали аликвоту и анализировали с использованием медиаторной системы. Пока концентрация антиоксиданта превышает концентрацию радикалов, генерируемых в единицу времени (Wiср·107 =1,87±0,03 М·с -1), на кривой зависимости потенциала медиаторной системы от времени наблюдается падение потенциала за счет взаимодействия АО с окисленным компонентом медиаторной системы. После того, как АО израсходуются, спад на кривой зависимости потенциала медиаторной системы от времени исчезает. Врем