ТЕГИ
Разработка электрооптических систем детекции клеток микроорганизмов, экспрессного мониторинга их морфометрических характеристик и физиологических параметров
Разработка электрооптических систем детекции клеток микроорганизмов, экспрессного мониторинга их морфометрических характеристик и физиологических параметров. Development of electro-optical systems, detection of cells of microorganisms, express monitoring of their morphological characteristics and physiological parameters.
Исполнитель: Федеральное государственное учреждение науки «Государственный научный центр вирусологии и биотехнологии »Вектор" Федеральной службы по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека (ФГУН ГНЦ ВБ «Вектор» Роспотребнадзора), Т. С. Бакиров, В. М. Генералов, А. В. Пак, М. В. Кручинина, Г. А. Буряк, А. С. Сафатов, Ю. Н. Мистюрин, Е. Т. Бакирова, И. С. Андреева, Е. П. Сухенко*, Н. Б. Лисицын*
Соисполнители: *Научно техническое учреждение «Инженерно-технический центр» открытого акционерного общества «Ижевский моторный завод — Аксион холдинг»
Разработана лабораторная установка электрооптической системы детекции клеток (ЭОСДК), которая соединила в себе методы цитоморфометрии, денситометрии и диэлектрофореза, а также отбора проб биологических агентов (БА) непосредственно из атмосферы. Лабораторная установка включает в себя: систему пробоотбора, одноразовую или проточную измерительную ячейку, генератор переменного напряжения, микроскоп, видеокамеру, и компьютер со специализированной программой анализа изображений. Устройство пробоотбора аэрозольных частиц из атмосферы выполнено в виде виртуального импактора. ЭОСДК позволяет проводить измерения 19 параметров клеток микроорганизмов. Среди них: радиус клетки; средне квадратичное отклонение радиусов клеток; a/b– степень эллиптичности клетки, a – большая полуось, b – малая полуось; индекс агрегации клеток; жесткость клетки; вязкость клетки; поляризуемость клетки; проводимость клеточной мембраны; емкость клеточной мембраны; дипольный момент клетки; заряд клетки; равновесная частота клетки; ?c (f100 kHz)/ ?c (f1MHz)– отношение поляризуемостей клетки на частоте 100 кГц к поляризуемости на 1 МГц; индекс деструкции клетки в электрическом поле; амплитуда деформации клетки; скорость движения клетки; концентрация клеток (число клеток в измерительном объеме); цвет клетки; форма клетки. На базе выше перечисленных характеристик БА строятся 18 гистограмм и рассчитываются 11 статистических характеристик.
The laboratory device of electro optical system detection of cells (EOSDC) is developed. It has united simultaneously methods of cytomorphometry, densitometry and dielectrophoresis, and also sampling of biological agents from an atmosphere. The laboratory device includes: system of sampling, a disposable or flowing measuring cell, the generator of the alternative electric field, the microscope, the video camera, and the computer with the specialized program of the analysis of the images. The device for sampling of aerosol particles from air made as the virtual impactor. EOSDC take measure of 19 parameters BА. Among it: radius of a cell; mean square deviation of radiuses of cells; a/b-a degree of elliptical of cells, a — greater semi-axle, b — small semi-axle; an index of aggregation of cells; rigidity of cell; viscosity of cell; polarizability of cell; conductivity of a cellular membrane; capacity of a cellular membrane; the dipole moment of a cell; charge of cell; equilibrium frequency of a cell; ?c (f100 kHz)/ ?c (f1MHz)- — the ratio polarizability of cells on frequency 100 kHz to polarizability on 1 MHz; index of destruction of cell in an electric field; amplitude of deformation of a cell; speed of movement of a cell; concentration of cells (number of cells in measuring volume); color of a cell; the form of a cell. On the basis of above listed characteristics BA the 18 histograms are constructed and 11 statistical characteristics are calculated.
Детекция клеток микрорганизмов среди которых можно выделить клетки, микроорганизмы, бактерии, вирусы является актуальной задачей в биологии, медицине, вирусологии, ветеринарии, а также для защиты населения от возможных последствий экологических или техногенных катастроф. Детекция представляет достаточно сложную комплексную задачу, которая по многим причинам не имеет однозначного методического решения. Основная сложность заключается в том, что клетки микрооргнизмов в процессе своего роста (развития), метаболизма постоянно изменяются. Например, бактерии могут иметь как вегетативную, так и споровую форму, вирусы могут находиться как в суспензии, так и внутри клеток. Данные обстоятельства определяют широкий спектр подходов и методов детекции и идентификации клеток, микроорганизмов. Кроме того, нет единого метода, который удовлетворял бы условиям чувствительности, специфичности, а также скорости детекции клеток микроорганизмов. Исходя из сказанного, существует необходимость в поиске и разработке принципиально новых, более совершенных методов.
Цель НИР: Создание электрооптических систем детекции клеток микроорганизмов, экспрессного мониторинга их морфометрических характеристик и физиологических параметров – фазы жизненного цикла, метаболического статуса и пр., основанных на оптической детекции эффектов поляризуемости клеток при действии на них электрического зондирующего поля.
Для достижения цели выполнялись следующие основные задачи:
1. Выбор и обоснование функциональной схемы электрооптических систем детекции клеток микроорганизмов,
2. Разработка устройства отбора проб БА из атмосферы;
3. Перевод проб БА в физиологический раствор;
4. Выбор и обоснование методов зондирования БА в ЭОСДК;
5. Теоретическое исследование метода диэлектрофореза для применения в ЭОСДК;
6. Экспериментальное исследование эффективности ЭОСДК.
Выбор и обоснование функциональной схемы электрооптических систем детекции клеток привел авторов к целесообразности объединения методов цитоморфометрии, денситометрии и диэлектрофореза, а также отбора проб биологических агентов (БА) непосредственно из атмосферы. Совокупность этих методов позволяют охарактеризовать БА по широкому ряду уникальных параметров (размер, форма, цвет, электрический заряд и т.д.). Перечисленные методы реализуются на основе анализа изображения (образа) клеток с помощью специализированных компьютерных анализаторов и программ. Компьютерный анализатор изображений — это рабочее место, позволяющее решать задачи, связанные с вводом, преобразованием и анализом цветных или черно-белых изображений. В состав анализатора входят микроскоп (при работе с микроскопическими образцами), видеокамера или фотоаппарат, компьютер, программное обеспечение и принтер. Заложенные в основу работы компьютерных анализаторов изображений принципы и технические приемы (микроскопия препарата, видеозапись, передача изображения в компьютер, обнаружение, подсчет, измерение и классификация клеток) являются универсальными для анализа микрообъектов любой природы. Данное обстоятельство является существенным достоинством, которые определили выбор способа решения поставленных задач.
Одной из основных особенностей разработанной ЭОСДК состоит в том, что для детекции БА дополнительно используется диэлектрофорез. Метод диэлектрофореза позволяет определять совокупность биофизических характеристик клетки, которые не доступны другим технологиям. Среди них можно выделить: поляризацию, индуцированный дипольный момент, проводимость, емкость мембраны и цитоплазмы, жесткость, вязкость и тд.
На данный момент, разработанная ЭОСДК способна измерять 19 характеристик клетки, построить на этих параметрах до 18 гистограмм, определить 11 статистических характеристик. Такого количества параметров не предлагает ни одна из существующих технологий и приборов, которые существуют на рынке. Кроме того, она имеет значительные потенциальные возможности расширения измеряемых параметров, например, применительно к хромосомам.
Действующая лабораторная ЭОСДК включает в себя: систему пробоотбора, одноразовую или проточную измерительную ячейку, генератор переменного напряжения, микроскоп, видеокамеру, и компьютер со специализированной программой анализа изображений.
Устройство пробоотбора аэрозольных частиц из атмосферы выполнено в виде виртуального импактора. Виртуальный импактор состоит из двух каналов для ввода чистого воздуха и одного для ввода исследуемого аэрозольного потока и трех каналов для вывода аэрозольного потока с различными размерами аэрозольных частиц (< 1,25 10-6 м, от 1,25 10-6 м до 5 10-6 м и > 5 10-6 м). Виртуальный импактор предназначен для концентрирования аэрозольных частиц из большого объема воздуха в малый объем (из 40 л/мин в 4 л/мин.). Это первая часть концентрирования аэрозольных частиц. Вторая часть концентрирования аэрозольных частиц происходит в устройстве для перевода аэрозольных частиц из воздуха в жидкость (жизнеобеспечивающий раствор). В этом устройстве поток воздуха с концентрированными аэрозольными частицами с заданными размерами разбивается на большое количество малых потоков (в данном макете пробоотборника — 40 потоков) и проходит через слой тангенциально закрученного жизнеобеспечивающего раствора. При этом частицы из атмосферы переходят в жидкость. На этом этапе величина концентрирования может достигать 10000.
Измерительные ячейки состоит из предметного стекла, на поверхности которого имеются металлические электроды. Между электродами расположена измерительная камера, в которой производятся измерения и наблюдения. На электроды измерительной ячейки подают напряжение от генератора переменного напряжения. С помощью видеокамеры регистрируют динамику движения отдельных клеток в измерительной камере. С видеокамеры видеосигнал динамики движения клеток подают компьютер.
ЭОСДК для каждой отдельно наблюдаемой клетки измеряет:
1. Rc – радиус клетки;
2. – ?rc – средне квадратическое отклонение радиусов клеток;
3. – ellc = a/b– степень эллиптичности клетки, a – большая полуось, b – малая полуось;
4. – Iagg – индекс агрегации клеток;
5. – kc – жесткость клетки;
6. – ?c – вязкость клетки;
7. – ?c – поляризуемость клетки;
8. – ?mc – проводимость клеточной мембраны;
9. – Cmc – емкость клеточной мембраны;
10.– dc – дипольный момент клетки;
11. — qc – заряд клетки;
12. – fc – равновесная частота клетки;
13. – ?c = ?c (f100 kHz)/ ?c (f1Mhz)– отношение поляризуемостей клетки на частоте 100 кГц к поляризуемости на 1 МГц;
14. – Icd – индекс деструкции клетки в электрическом поле;
15. – Amc – амплитуда деформации клетки;
16. – Vc – скорость движения клетки;
17. – Сc – концентрация клеток (число клеток в измерительном объеме);
18. – Clc – цвет клетки;
19. Fc – форма клетки.
Если отдельная клетка отличается от других хотя бы по одной характеристики на уровне ДА – НЕТ, то при наличии для нее k=19 характеристик, эффективность распознавания составит N=2 k= 2 19 =524288. Другими словами ЭОСДК различит ее из совокупности 524288 наблюдаемых клеток. Разрешающая способность ЭОСДК для ряда характеристик клетки, например, таких как: скорость движения, диаметр, амплитуда деформации клетки значительно лучше, чем уровень ДА – НЕТ, поэтому реальная эффективность ЭОСДК значительно лучше.
Практическое значение работы.
ЭОСДК найдет применение в:
— вирусологии, биотехнологии, биологии, экологии для характеризации клеточного материала, оценки состояния культур клеток и вирусов в процессе их культивирования и хранения, определения концентрации клеток в клеточных суспензиях.
Внедрение ЭОСДК в широкую медицинскую практику позволит:
— кардинально изменить положение дел в практической медицине с оценкой и измерением вязкоупругих характеристик эритроцитов;
— поднять диагностику ряда заболеваний печени и сердца человека на новый, более высокий уровень.
Эксплуатация ЭОСД в России позволит;
— создать ~5000 — 10000 рабочих мест в сегменте высоких технологий. (Из расчета одна установка – одно рабочее место);
- расширить рынок услуг в области диагностики заболеваний человека.
В России потенциальная стоимость:
— рынка для конкретного устройства ЭОСДК (как прибора) составляет ~350 000 000 рублей,
— рынка услуг (проведение измерений вязкоупругих характеристик эритроцитов для 140 млн. человек) составит 14 миллиардов рублей в год. Из расчета один человек — один анализ — 100 рублей в год.
Выводы, в результате проведенной работы созданы:
— лабораторная установка электрооптической системы детекции клеток. Установка позволяет измерять 19 характеристик клеток, строить на этих параметрах до 18 гистограмм, определять до 11 статистических характеристик клеточного пула. ЭОСД характеризуется высокой чувствительностью, простотой в эксплуатации, низкой стоимостью одного анализа, а также высокой производительностью;
— одноразовая и проточная измерительные камеры;
— разработан пакет компьютерных программ для детекции клеток;
— ЭОСД может быть положена в основу нового направления производства измерительных приборов для проведения анализа и детекции клеток в области биологии, медицины, вирусологии, ветеринарии и т д.
Литературные источники:
1. Бакиров Т.С. Демыгина Е. Разработка электрооптических систем детекции клеток микроорганизмов. Ежемесячный научно-информационный журнал «Scientific American. В мире науки», 2006. № 8. С. 74-77.
2. Бакиров Т.С. Бархатова Т. Экспресс-система для анализа клеток. sciencerf.ru/client/fcntp.aspx?ob_no=2825&cat_ob_no=561 8 июня 2006 г.
3. Бакиров Т.С., Генералов В.М., Пак А.В., Звольский И.Л. Кручинина М.В., Курилович С.А. Способ измерения вязко-упругих характеристик клеток биологических объектов, способ дифференциальной диагностики диффузных заболеваний печени алкогольной и вирусной природы и устройство для осуществления указанных способов. Международная заявка PCT/RU2004/000336 от 09.09.2004, положительное решение от 01.09.2006
4. Сухенко Е.П., Бакиров Т.С. Соловьев А.А. Генералов В.М. Васильев Ю.В. Пак. А.В. Способ комплексного анализа параметров живых клеток, устройство для его осуществления и его варианты. Заявка № 206100448 от 10.02.2006
